دانشگاه آزاد اسلامی واحد دامغان
پایان نامه کارشناسی ارشد رشته زیست شناسی
با عنوان :
انتروباکتریاسه
برای رعایت حریم خصوصی نام نگارنده درج نمی شود
تکه هایی از متن به عنوان نمونه : (ممکن است هنگام انتقال از فایل اصلی به داخل سایت بعضی متون به هم بریزد یا بعضی نمادها و اشکال درج نشود ولی در فایل دانلودی همه چیز مرتب و کامل است)
مواد غذایی محیط های بسیار مناسبی برای رشد انواع میکروب ها، انگل ها و حشرات می باشند و بدیهی است که در معرض فساد و بیماریزایی قرار دارند (کریم، 1382). در حال حاضر فساد و مسمومیت های ناشی از مصرف غذاهای آلوده سالیانه زیان های مالی و جانی بسیاری را بر جوامع انسانی وارد می سازد. به عنوان مثال هزینۀ هر مورد از موارد ابتلاء به اسهال نوزادان حداقل پنجاه دلار برآورد شده است که در سطح جهان هزینه ای که در این رابطه بااین بیماری در همان سال مصرف شده به پنجاه میلیارد دلار می رسد (ابراهیمی محمدی، 1388). زیان های ناشی از مسمومیت های غذایی را اگر به اختصار بیان کنیم عبارتند از هزینه های پزشک، بستری شدن، درمان، درمان های حمایتی، هزینه های ناشی از حذف غذاهای آلوده، کنترل محصولات، پژوهش در این زمینه و پیگیری آن، کاهش سرمایه، کاهش ارزش صادرات، کاهش تولید، کاهش درآمد توریسم و نظیر آن ها (رضویلر، 1381). موارد مذکور وقتی که با کمبود مواد غذایی در جوامع غیر صنعتی همراه شود، بیشتر نمود پیدا می کند. با توجه به افزایش روزافزون افراد بشری و نیز با در نظر داشتن این موضوع که سلامت جسمی در گروی تغذیۀ صحیح و اصولی می باشد، نیاز به حفظ منابع موجود غذایی در حد امکان بیشتر می شود (Varnam,1991).
امروزه استفاده از غذاهای آماده و نیمه آماده در فروشگاه های مواد غذایی، رستوران ها و اغذیه فروشی ها به صورت گرم و سرد رو به افزایش گذاشته است. در این بین گوشت قرمز فراورده ایست که مصارف زیادی به صورت مصرف مستقیم در منازل، رستوران ها، کبابی ها، در تهیۀ انواع فراورده های گوشتی نظیر همبرگر، سوسیس و کالباس، کلوچه های گوشتی و…. دارد که با توجه به مصرف زیاد این مادۀ غذایی توجه به کیفیت، سلامت و بهداشت آن بیش از پیش مورد توجه قرار گرفته است و در این راستا توصیه ها و دستورالعمل های زیادی به منطور ارزیابی و کنترل بهداشتی این ماده از تولید تا مصرف ارائه شده است.
توجه به این نکته که با وجود پیشرفت علوم و صنایع غذایی، بیماریهای ناشی از غذا به عنوان مهمترین مسئله در جهان باقی مانده است و اینکه در سراسر جهان صدها میلیون انسان به بیماریهای قابل انتقال از طریق غذا و آب مبتلا می شوند، دقت در ارزیابی ها را بیشتر نمایان می سازد. این مسئله در كشورهای در حال توسعه و در میان افرادی كه به ضعف سیستم ایمنی و یا سوء تغذیه مبتلا هستند در حال افزایش است. نکتۀ قابل تأمل این است که در حین دهه گذشته، افزایش قابل توجهی در گزارش بیماری های ناشی از غذاهای آلوده وجود داشته است. یكی از روش های اجتناب از آلودگی، عرضه مواد غذایی به صورت بسته بندی است. امروزه در اكثر كشور های صنعتی مواد غذایی پروتئینی، لبنی، سبزیجات و میوه جات و بسیاری از مواد غذایی دیگر خام و پخته شده جهت حفظ سلامتی مردم به صورت بسته بندی عرضه می گردد. متأسفانه در كشور ما هنوز بسیاری از مواد غذایی و از جمله گوشت به صورت سنتی تهیه و عرضه می گردد. البته لازم به ذکر است که با وجود گسترش زندگی صنعتی همزمان با رشد تکنولوژی و توسعه مراکز تهیه مواد غذایی، که رواج غذاهای بسته بندی شده و آماده مصرف و توسعه صادرات و واردات آن ها در سطح بین المللی را به دنبال داشته است، این گونه تسهیلات با وجود این که توانستند در سطح وسیعی مسئله تقاضای روز افزون مواد غذایی را پاسخگو باشند، ولی خود مسائل جدید از قبیل گسترش همه گیری مسمویت های غذایی را به دنبال داشته است. از طرفی دیگر با افزایش جمعیت انسانی در سطح جهان روبه رو هستیم ( سلطان دلال، م. و همکاران، 1386).
در میان باكتری های بیماریزا گونه های سالمونلا در ارتباط با شیوع در محدوده گوناگونی از غذاها شامل ماهی، لبنیات، سبزیجات، گوشت و فرآورده های گوشتی بوده اند. مطالعات انجام شده نشان داده كه فراوانی آلودگی گوشت به سالمونلا در كشورهای مختلف متفاوت است. آلودگی مواد غذایی با این پاتوژن ممكن است در مراحل مختلف زنجیره غذایی شامل تولید، فرآوری، توزیع، خرده فروشی ها و دست زدن یا آماده نمودن ایجاد شودطبق بررسی های به عمل آمده تعداد افراد مبتلا به بیماری سالمونلوز در طول یکسال در ایالات متحده حدود 2 میلیون نفر تخمین زده می شود. عمدتاً پذیرفته شده که سالمونلوز از طریق خوردن مواد آلوده منتقل می شود.
امروزه سالمونلا با بیش از 2600 سرووار یکی از شایع ترین علت های مسمومیت در جهان است. باعث بروز بیماری در بسیاری از افراد در طول سال می شود و اکنون سال هاست که سالمونلوزیس در بسیاری از کشورها تحت کنترل است و به نظر می رسد این میکروب مسئله ای علیه عموم بوده باشد. مرگ و میر ناشی از این میکروب کمتر از بقیۀ بیماری های منتقله از راه غذاست، ولی شیوع بالایی دارد.
این باکتری معمولاً لولۀ گوارش و و دستگاه لنفاوی را درگیر می کند و در صورت عدم درمان فوری حتی ممکن است به مرگ منتهی شود. همۀ افراد در معرض خطر آلودگی هستند، ولی افراد پیر، کودکان و کسانی که نقص سیستم ایمنی دارند بیشتر در معرض خطر هستند. همچنین در مناطقی که از نظر بهداشتی، اقتصادی و اجتماعی پایین هستند، شایع تر است.
شناسایی سالمونلا در گوشت و بسیاری از مواد غذایی به طور معمول از طریق کشت میکروبی انجام می شود. اما این روش ها زمان برند. و دقت و حساسیت کافی ندارند. برخی از آزمون های سرولوژیکی نیز مورد استفاده دارند. اما آن ها نیز محدودیت های خاص خود را دارند.
با توجه به مطالب فوق و ذکر و مخاطراتی که سالمونلوز از نظر بهداشت عمومی و بیماریهای مشترک بین انسان و دام دارد عنوان پایان نامه حاضر جهت بررسی این مسئله انتخاب شده است. چنانچه اهداف این تحقیق آن بود که با استفاده از آغازگرهای اختصاصی و با کمک روش Multiplex-PCR تشخیص سریع باکتری سالمونلا که حاوی ژن invA به عنوان عامل حدت می باشد، در گوشت گاو تازه توزیع شده در سطح فروشگاه های گوشت شهرستان سنندج مورد بررسی قرار گرفت و بدینسان درصد آلودگی گوشت تازۀ گاو به باکتری سالمونلا به روش مذکور مشخص گردید. همچنین با استفاده از تشخیص پرایمرهای اختصاصی flic و Prot6E جدا سازی گونه های سالمونلا تایفی موریوم(Salmonella typhimorium) و سالمونلا انتریتیدیس (Salmonella enetritidis) اعمال شد و درصد آلودگی به این میکروارگانیسم های بیماریزا مشخص گردید. باشد که به دنبال پژوهشهای فراوانی که تا کنون انجام گرفته، این پایان نامه نیز بتواند به عنوان قدمی هر چند کوچک در تحقیقات گسترده تری که در آینده و در این رابطه انجام می پذیرید مفید و موثر واقع گردد.
خانواده انتروباکتریاسه[1]
1-1-2
خانواده انتروباکتریاسه، بزرگ ترین و نامتجانس ترین مجموعه از مهم ترین باسیل های گرم منفی را تشکیل می دهد (موری، 1371). انتروباکتریاسه ها در طبیعت بسیار فراوان هستند. در روده حیوانات (مخصوصاً پستانداران)، روده انسان، خاک، آب، غبار هوا و گاهی برخی فرآورده های غذایی و سبزیجات آلوده نیز وجود دارند(همتی، 1370).
آلودگی آب به مدفوع از طریق اثبات حضور اشرشیا کولای[2] که زیستگاه طبیعی آن روده است مشخص می گردد.گونه های کلسیلا[3]
شامل کلسیلا پنومونیه[4]، انتروباکتر[5] و سیتروباکتر[6]، از سبزیجات، خاک اره و بستر اسب ها جدا شده اند (کارتر و وایس، 2004). تعدادی از اعضای این خانواده(نظیر شیگلا[7] ، سالمونلا[8] و یرسینیا[9]) همیشه به همراه بیماری های انسانی مشاهده می شوند، در حالی که عده ای دیگر (نظیر اشرشیا کولای، کلبسیلا پنومونیه و پروتئوس میرابیلیس[10]) علاوه بر این که در حالت فیزیولوژیک در فلور طبیعی یافت می شوند، قادر به ایجاد عفونت های فرصت طلب[11] نیز می باشند (موری، 1371). بعضی از آن ها جزء فلور معمولی روده نمی باشند مثل سالمونلا و شیگلا. یعنی چنان چه از کشت مدفوع به دست آیند دلیل بر بیماری و یا ناقل بودن شخص خواهد بود (همتی، 1370). باکتری های روده ای مسئول اغلب عفونت های بیمارستانی می باشند (رحیمی، 1386).
در این خانواده مهم ترین عوامل بیماری های گوارشی از قبیل عامل تب تیفوئید[12] و دیسانتری باسیلی وجود دارد (رحیمی، 1386).
2-1-2طبقه بندی:
تمایز و تعیین صفات انتروباکتریاسه ها بر پایه انواع واکنش های بیوشیمیایی، کشت و ساختار آنتی ژنی استوار است. انتروباکتریاسه ها با این روش های معمولی بیش از سایر باکتری ها شناخته شده اند. تمایز دقیق بین گونه های انتروباکتریاسه امکان پذیر نیست و گاهی مشخص کردن سویه های حد واسط دشوار می باشد. ناکافی بودن ملاک های تمایزی معمول به عنوان اساس رده بندی رسمی در این خانواده به چشم می خورد. امروزه معلوم گردیده که انتروباکتریاسه ها را می توان فراتر از رده و جنس و گونه تقسیم بندی کرد و این تقسیم بندی فراتر بر اساس روابط ژنتیکی به ویژه ترکیب ژن های کروموزومی بین گونه ها انجام می گیرد (گلباز جباری، 1375).
تا سال 1972 تنها 26 گونه در این خانواده نام گذاری شده بود در صورتی که در حال حاضر بیش از 28 جنس و 86 گونه در این خانواده وجود دارد و 11 دسته[13] دیگر نیز به عنوان گروه های روده ای وابسته ذکر می شوند که برای نام گذاری احتیاج به بررسی بیشتری دارند. خوشبختانه تنها 25 گونه از باکتری های خانواده انتروباکتریاسه پاتوژن های مهمی برای انسان و حیوانات بوده و از نمونه های مرضی جدا می شوند. گونه های دیگر به ندرت از انسان گزارش شده اند (زهرائی صالحی، 1378؛ شیمی، 1376).
بیشتر عفونت های بالینی مربوط به چند جنس معدود است که عبارتند از: اشرشیا کولای، پروتئوس، کلبسیلا، سالمونلا، شیگلا، یرسینیا و انتروباکتر. 72 گونه دیگر فقط 1 تا 2 درصد از موارد بالینی را شامل شده اند (رحیمی، 1386؛ جاکلیک و همکاران، 2003).
3-1-2مورفولوژی:
باکتری های خانواده انتروباکتریاسه، باسیل های گرم منفی با اندازه متوسط (6-1 ´ 1-3/0 میکرومتر) و فاقد هاگ می باشند. برخی از این باکتری ها دارای تاژک از نوع اطرافی[14] بوده و در نتیجه متحرک می باشند، در صورتی که برخی دیگر نظیر شیگلا و کلبسیلا فاقد تاژک و غیرمتحرک اند. البته گونه تاتوملاپتیسئوس[15] برخلاف باکتری های متحرک این خانواده به وسیله تاژک های جانبی یا قطبی و تحت قطبی حرکت می کند. برخی از گونه ها دارای فیمبریه یا پیلی می باشند که باعث بروز خصوصیات جدید در این گونه ها از جمله خاصیت چسبندگی و اتصال به گلبول های قرمز و مخاط روده میزبان می گردد. همچنین برخی از باکتری های این خانواده دارای لایه لعابی به نام کپسول هستند که این ساختمان بیرونی در کلبسیلا مشخص تر است (زهرائی صالحی، 1378؛ شیمی، 1376). در برخی مانند اشرشیا کولای به صورت یک لایه نازک می باشد و در برخی دیگر وجود ندارد (همتی، 1370). دیواره سلولی از مورئین[16]، لیپوپروتئین، فسفولیپید و لیپوپلی ساکاریدها تشکیل شده که به صورت لایه هایی بر روی یکدیگر قرار گرفته اند. قسمت لیپوپلی ساکاریدی حاوی زنجیره های جانبی اختصاصی پلی ساکاریدی است که صفات آنتی ژنی گونه های مختلف را تعیین و همچنین دارای فعالیت آندوتوکسینی است (جاکلیک و همکاران، 2003).
4-1-2خواص کشت:
همه باکتری های این خانواده در شرایط هوازی و بیهوازی رشد کرده و به اصطلاح بیهوازی اختیاری هستند (زهرا صالحی، 1378). بافت ها، مدفوع، بخشی از روده، ادرار، شیر، خون و سایر نمونه های بالیتی جهت کشت مورد استفاده قرار می گیرند (کارتر و وایس، 2004).
تمامی آن ها روی محیط معمولی ژلوز و آبگوشت مغذی به خوبی رشد می کنند. در محیط آبگوشت مغذی به طور کلی بعد از 24 ساعت کدورت یکنواخت ایجاد می کنند، طوری که اگر لوله کشت را تکان دهیم، منظره خاصی را مشاهده خواهیم کرد (همتی، 1370).
در محیط های غیر اختصاصی مثل اگار خون دار یا اگارانفوزیون تمامی آن ها در شکل کلونی های مرطوب، خاکستری و صاف ظاهر می شوند، لذا گونه های مختلف تفکیک نیستند. گاهی تغییر شکل کلونی ها از فرم S به فرم R دیده می شود و کلونی های مربوط به برخی سوش ها همولیز بتا ایجاد می کنند (جا کلیک و همکاران، 2003).
باکتری های خانواده انتروباکتریاسه در سطح وسیعی از درجه حرارت رشد می کنند ولی درجه حرارت مناسب اکثر آن ها 37 درجه سانتی گراد می باشد (زهرا صالحی، 1378).
در مواردیکه انتروباکتریاسه ها باید از نمونه های آلوده جدا شوند از محیط های انتخابی استفاده
می شود. در این محیط ها مهار کننده هایی مثل نمک های صفر اوی یا رنگ هایی مانند ائوزین، متیلن بلو.
بریلیات ستگسرین افزوده شده است که از رشد باکترهای گرم مثیت جلوگیری می کند. از این
محیط های انتخابی کشت اکار مک کانکی، اکاردراکسیکسولات و محیط کشت EMB قابل ذکر هستند.
در محیط های کشت EMB و مک کانکی، معروف های زنگی و جند قند قابل تخمیر مانند لاکتوز اضافه شده است، لذا در این محیط ها، جرم هایی که قدرت تخمیر لاکتوز را دارند کلونی هایی به رنگ قرمز ایجاد می کنند. به همین علت به این محیط ها، محیط های کشت افتراقی نیز گفتهمی شود. اعضای جنس آنتروباکتر، اشرشیاکولای و اغلب گونه های جنس کلبسیلا حاوی کلونی های تخمیر کننده لاکتوز هستند اما پاتوژن روده ای مانند سالمونلا و شگیلا تخمیر لاکتوز را نداند و در شکل کلونی های بی رنگ مشاهده می شوند.
باکتری های جنس سالمونلا و شگیلا در برابر تاثیر مهارکنندگی سیترات (نسبت به بقیه اعضای خانواده) مقاوم تر هستند، از این ویژگی ها در طراحی محیط های کشت و انتخابی دیگری استفاده شده است.
محیط کشت اگار سالمونلا- شگیلا (SSآگار) که حاوی سیترات و نمک های صفراوی است و برای جداسازی پاتوژن های روده ای استفاده می شود و محیط های کشت بریلیات گرین (BG) و یا ییسموتسولفیت (BS) که قدرت انتخاب بالایی برای جدا سازی سالمونلا دارند (رحیمی، 1386).
